辅助细胞1、2细胞因子平衡与正常妊娠及习惯性流产关系的初步探讨

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辅助细胞1、2细胞因子平衡与正常妊娠及习惯性流产关系的初步探讨

居中亮　范丽安　陆丽华　吴乾渝

　　【摘要】　目的　探讨T辅助细胞1（Th1）细胞因子(γ干扰素、肿瘤坏死因子α)、Th2细胞因子(白细胞介素4、白细胞介素10)平衡在母胎免疫耐受中的作用机理。方法　用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测11例正常未妊娠妇女、10例正常早期妊娠妇女、11例正常晚期妊娠妇女、11例习惯性流产患者的外周血单个核细胞内γ干扰素、肿瘤坏死因子α、白细胞介素4、10 mRNA表达水平的相对含量(%)。结果　(1)白细胞介素10：正常未妊娠妇女为(13.58±3.91)%,正常早期妊娠妇女为 (18.61±5.43)%，正常晚期妊娠妇女为(20.72±5.36)%，习惯性流产妇女为(9.48±2.84)%，后者明显低于前3者 (P<0.05)。(2)γ干扰素:正常未妊娠妇女为(30.76±5.35)%，正常早期妊娠妇女为(27.23±5.74)%，正常晚期妊娠妇女为(24.68±5.55)%，习惯性流产妇女为(36.08±5.75)%，后者明显高于前3者(P<0.01)。(3)肿瘤坏死因子a水平在以上4种妇女之间比较,差异无显著性(P>0.05)。结论　正常妊娠是以分泌Th2细胞因子为主的，当发生偏向性地分泌炎性Th1细胞因子时，可能会导致习惯性流产的发生，提示Th1与Th2细胞因子平衡在母胎免疫耐受中起一定作用。
　　【关键词】　Th1细胞; Th2 细胞;细胞活素类；妊娠; 流产，习惯性; 聚合酶链反应

Study on Normal Pregnancy and Recurrent Spontaneous Abortions from Helper T Cell 1/Helper T Cell 2 Cytokines Balance

JU Zhongliang,FAN Lian
（Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China）
LU Lihua, et al.

　　【Abstract】　Objective 　To investigate the function of Th1 (IFN-γ,TNF-α) and Th2 (IL-4, IL-10) cytokine balance in the maternal-fetal tolerance. Methods　The IFN-γ, TNF-α, IL-4, and IL-10 mRNA were studied from PBMCs of 11 normal non-pregnancy control, 10 women in first trimester of normal pregnancy, 11 women in last trimester of normal pregnancy by semi-quantitative reverse transcriptional-polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Results　(1) The IFN-γmRNA decreased ［(24.68±5.55)%, P<0.05］, while the IL-10 mRNA rose ［(20.72±5.36)%, P<0.01］ in normal pregnancy women compared with the non-pregnancy control ［IFN-γ(30.76±5.35)%, IL-10 (13.58±3.91)%］. (2) IL-10 mRNA decreased ［(9.48±2.84)%, P<0.05］, while the IFN-γmRNA rose ［(36.08±5.75)%, P<0.05］ in RSA women compared with the non-pregnancy control. (3) The IFN-γmRNA rose (P<0.01), while the IL-10 mRNA decreased (P<0.01) in RSA women compared with women in their first trimester of normal pregnancy ［IFN-γ(27.23±5.74)%, IL-10 (18.61±5.43)%］. Conclusions　 The results suggest that women in normal pregnancy had mainly the Th2 cytokines. The breakage of the Th1/Th2 balance may result in RSA. The results provide clue that Th1/Th2 balance plays a role in maternal-fetal tolerance.
　　【Key words】　Th1 cell; Th2 cells； Cytokines; Pregnancy; Abortion, habitual; Polymerase chain reaction

　　从免疫学的角度来看，妊娠是这样一个过程，即带有父方异体抗原的胚胎，对母体来说是一个移植物，母体免疫系统识别并产生保护性免疫应答，直至胎儿娩出。但其中的免疫保护机理不甚明了。近年来对T辅助细胞1（Th1）、T辅助细胞2（Th2）亚型的研究，取得令人瞩目的进展。发现Th1、Th2细胞因子平衡与妊娠结局关系密切^［1］。本研究用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测正常未妊娠妇女、正常妊娠妇女及习惯性流产患者的外周血单个核细胞内，Th1细胞因子（γ干扰素、肿瘤坏死因子α）及Th2细胞因子（白细胞介素4、10） mRNA的表达水平，以探讨Th1、Th2细胞因子平衡在母胎免疫耐受中的作用。现将研究结果报道如下。

资料与方法

　　一、研究对象
　　1998年1月～1998年3月间，选择上海第二医科大学基础医学院正常未妊娠年轻妇女11例（正常未妊娠组），年龄（29.5±3.9)岁。均无急慢性疾病史及自身免疫疾病史。 1998年3月～1998年6月间，选择上海市东方医院妇产科住院妊娠妇女21例（正常妊娠组），年龄（26.0±3.6)岁。其中妊娠早期10例，孕（7.4±1.7)周；妊娠晚期11例，孕（37.2±2.1)周。既往无高血压、糖尿病、慢性肾炎等疾病，无输血史。1998年1月～1998年10月间，选择上海市第六人民医院妇产科确诊的习惯性流产患者11例（习惯性流产组），年龄（30.1±4.2)岁。
　　二、方法
　　1.试剂：淋巴细胞分离液Ficoll为上海试剂二厂产品，细胞培养液RPMI1640为丹麦GIBCO公司产品，植物血凝素为美国Sigma公司产品，细胞总 RNA抽提药盒TRIzol为丹麦GIBCO公司产品，逆转录药盒Superscript II为丹麦GIBCO公司产品，Taq酶为德国Sangon公司产品，琼脂糖凝胶为法国Biowest公司产品。
　　2.引物：β-actin、γ干扰素、肿瘤坏死因子α、白细胞介素4、10引物由尹芝南博士(德国风湿病研究所)惠赠，引物序列见表1^［2］。
　　3.细胞因子的诱生：每例研究对象均采集静脉血5ml，肝素抗凝，Ficoll分离单个核细胞，用细胞培养液RPMI1640配成2×10⁶细胞/ml悬液，置于24孔培养板，加入植物血凝素至终浓度10 μg/ml,37℃ 5％二氧化碳培养24 h。
　　4.RT-PCR检测细胞因子mRNA相对含量：收集培养24 h细胞，TRIzol抽提细胞总RNA。按Superscript II药盒步骤，将mRNA逆转录为cDNA。用所得cDNA进行RT-PCR反应，扩增内参照β-actin及γ干扰素、肿瘤坏死因子α、白细胞介素4、 10细胞因子(PCR反应条件见表1)。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶(含终浓度0.5ug/ml溴乙锭)上电泳，经UVP扫描仪Grab-IT软件扫描，Gelwork1D软件进行灰度分析，得β-actin及4种细胞因子灰度值，将4种细胞因子灰度值分别除以β-actin灰度值，从而得到4种细胞因子相对含量（%）。
　　三、统计学方法
　　应用美国Raleigh公司SAS(6.03版本)统计软件，用GLM过程进行进行方差分析，用Dunnett检验进行组间比较。

结果

　　一、不同时间植物血凝素刺激培养对γ干扰素、肿瘤坏死因子α、白细胞介素4、10的诱生情况
　　植物血凝素刺激培养不同时间对4种细胞因子的诱生情况显示，未经植物血凝素刺激，白细胞介素4、10因基础表达太低而难以测出；经植物血凝素刺激培养 24 h后，白细胞介素4升高8倍，白细胞介素10升高6倍，有利于检出。所以本实验中，我们选择植物血凝素刺激24 h后进行4种细胞因子mRNA表达的检测。
　　二、3组妇女的4种细胞因子mRNA表达水平的比较
　　与正常未妊娠组相比，正常妊娠早期妇女白细胞介素10水平升高(P<0.05)；妊娠晚期妇女γ干扰素水平降低(P<0.05)，而白细胞介素10水平明显升高（P<0.01）。与正常妊娠组比较，习惯性流产组白细胞介素10水平降低(P<0.05)，γ干扰素水平升高（P<0.05)；与正常妊娠早期妇女比较，习惯性流产组γ干扰素水平明显升高(P<0.01)，白细胞介素10水平明显降低(P<0.01)。详见表2。

表1　PCR引物扩增片段大小及扩增条件

cDNA类别	引物序列	扩增条件	片段
β-actin	5′引物 5′-CGGGAAATCGTGCGTGACAT 3′引物 5′-GAACTTTGGGGGATGCTCGC	94℃5s；94℃1s，64℃1s，72℃1s(33次循环);72℃7s	712bp
γ干扰素	5′引物 5′-TCGTTTTGGGTTCTCTGGGC 3′引物 5′-GCAGGCAGGACAACCATTAC	94℃5s；94℃1s，61℃1s，72℃1s(33次循环);72℃7s	477bp
肿瘤坏死　因子α	5′引物 5′-CTCTGGCCCAGGCAGTCAGA 3′引物 5′-GGCGTTTGGGAAGGTTGGAT	94℃5s；94℃1s，62℃1s，72℃1s(33次循环); 72℃7s	519bp
白细胞介　素4	5′引物 5′-CTGCAAATCGACACCTATTA 3′引物 5′-GATCGTCTTTAGCTTTCC	94℃5s；94℃1s，51℃1s，72℃1s(33次循环);72℃7s	449bp
白细胞介　素10	5′引物 5′-CTGAGGACCAAGACCAGACATCAAGG 3′引物 5′-CAATAAGGTTTCTCAAGGGGCTGG	94℃5s；94℃1s，58℃1s，72℃1s(33次循环);72℃7s	352bp

表2　3组妇女4种细胞因子mRNA相对含量表达水平比较(％，±s)

组别	例数	γ干扰素	肿瘤坏死因子α	白细胞介素4	白细胞介素10
正常未妊娠组	11	30.76±5.35	28.81±5.42	8.36±2.65	13.58±3.91
正常妊娠组
早期妊娠妇女	10	27.23±5.74	32.11±6.26	8.16±2.30	18.61±5.43^*
晚期妊娠妇女	11	24.68±5.55^	27.38±6.00	10.70±2.74	20.72±5.36^
习惯性流产组	11	36.08±5.75^△△	31.25±6.06	7.71±2.40	9.48±2.84^△△

　　注：与正常妊娠组比较，^　P<0.05 ^　P<0.01；与正常妊娠早期妇女比较，^△　P<0.05 ^△△　P<0.01

讨论

　　90年代初，CD4⁺的Th根据其分泌细胞因子的不同,可分为Th1细胞和Th2细胞。其中Th1细胞主要分泌白细胞介素2、γ干扰素、肿瘤坏死因子α；Th2细胞主要分泌白细胞介素4、5、 10。Th1、Th2细胞有着不同的功能，Th1细胞介导迟发型超敏反应，Th2细胞可促使B细胞产生抗体。Th1、Th2细胞亚型相互制约，决定着机体细胞免疫与体液免疫间的平衡，这种平衡一旦被打破，将导致疾病的发生^［3］。1993年，Wegmann等^［4］在实验中发现，妊娠母鼠，其外周血淋巴细胞分泌的细胞因子中白细胞介素4、5、10水平升高，而γ干扰素水平降低。于是，他提出，妊娠是以Th2型细胞因子为主的生理现象。
　　使用PCR方法，可以快速、准确地检测目的基因的表达水平。在本研究中，我们使用半定量RT-PCR方法，即用各组织细胞中相对恒量表达的β肌动蛋白 (β-actin)为内参照，将细胞因子基因与β-actin基因同时进行PCR扩增后，根据细胞因子基因与β-actin 基因PCR扩增产物量的比值估算细胞因子基因的相对含量^［5］。我们在研究中发现，正常妊娠早期，白细胞介素10 mRNA表达已有升高；至正常妊娠晚期，白细胞介素10已明显升高，而γ干扰素降低。这一现象提示，正常妊娠是以分泌Th2细胞因子为主的。在习惯性流产患者中，白细胞介素10明显降低，而γ干扰素明显升高。这说明，当由生理性的Th2偏向炎性的Th1状态时，可能会导致习惯性流产的发生。因为炎性的 Th1型细胞因子可激活T、NK细胞，使胚胎遭受免疫杀伤，进而被排斥。我们的结果与国外报道^［6，7］基本一致，但并未发现习惯性流产患者中白细胞介素4降低，而肿瘤坏死因子α升高的现象。其可能的原因是：（1）实验组样本数偏小而造成无显著性差异；（2）白细胞介素4由于表达水平低而造成无显著性差异；（3）肿瘤坏死因子α由于标准差较大而造成无显著性差异。因此，加大样本数量及使用更灵敏的检测方法，这在以后的研究中是值得考虑的。
　　总之，Th1/Th2型细胞因子平衡对正常妊娠是十分重要的，当发生由Th2向Th1的偏离时，可能会导致习惯性流产的发生。细胞因子制剂用于习惯性流产动物模型的免疫治疗已取得较好的效果。雌鼠实验有较高的胚胎吸收率，发现雌鼠内白细胞介素2、γ干扰素和肿瘤坏死因子α有高水平表达，注射Th2型细胞因子白细胞介素10后，可降低雌鼠胚胎吸收率，反之，加入白细胞介素10单抗后，胚胎吸收率升高^［8］。细胞因子制剂用于临床习惯性流产的生物治疗的可行性，还有待人们不断探索。

(本文编辑：侯存明)

居中亮（200025 上海第二医科大学上海市免疫研究所）
范丽安（200025 上海第二医科大学上海市免疫研究所）
陆丽华（200025 上海第二医科大学上海市免疫研究所）
吴乾渝（200025 上海第二医科大学上海市免疫研究所）

参考文献

1，Raghupathy R. Th1-type immunity is incompatible with successful pregnancy. Immunol Today,1997,18:478-482.
2，Yin Z, Braun J, Neure L, et al. T cell cytokine pattern in the joints of patients with lyme arthritis and its regulation by cytokines and anticytokines. Arithritis Rheum, 1997,40:69-79.
3，Yin Z, Braun J, Neure L, et al. Crucial role of interleukin-10/interleukin-12 balance in the regulation of the type 2 T helper cytokine response in reactive arthritis. Arthritis Rheum,1997,40:1788-1797.
4，Wegmann TG, Lin H, Guilbert L, et al. Bidiretional cytokine interaction in the maternal-fetal relationship: is successful pregnancy a TH2 phenomenon Immunol Today,1993,14:353-356.
5，Yamamura M, Uyemura K, Deans RJ, et al. Defining protective responses to pathogens: cytokine profiles in Leprosy Lesions. Science,1991,254:277-279.
6，Marzi M, Vigano A, Trabationi D, et al. Characteration of type 1 and type 2 cytokine production profile in physiological and pathological human pregnancy. Clin Exp Immunol,1996,106:127-133.
7，Hill JA, Polgar K, Anderson DJ. T helper 1 type immunity to trophoblast in women with recurrent spontaneous abortion. JAMA,1995,273:1933-1936.
8，Tangri S, Wegmann TG, Lin H, et al. Maternal anti-placental reactivity in natural，immunologically-mediated fetal resorptions. J Immunol,1994,152:4903-4912.