【经典重读】微阵列比较基因组杂交技术在产前诊断中的应用研究进展

微阵列比较基因组杂交技术在产前诊断中的应用研究进展

符芳　廖灿

作者单位: 510623  广州市妇女儿童医疗中心优生围产研究所

出生缺陷约占新生儿总数的3%,出生缺陷的原因有遗传学因素、环境因素或者是两者共同作用。在高风险胎儿中,常规染色体核型分析异常检出率为2%~3%。而在产前超声检查提示结构发育异常的胎儿中,常规染色体核型分析异常检出率高达35%[1-3]。传统的G显带染色体核型分析技术通过对羊水、绒毛及脐血细胞进行分析,能够检出所有的非整倍体异常和较大的染色体结构异常,但不能检出<10 Mb的染色体结构异常[4]。荧光原位杂交(fluorescence in-situ hybridization,FISH)技术除了可以快速分析染色体数目异常外,还能够在中期细胞检测染色体的缺失或重复,以及判断标记染色体(supernumerary marker chromosomes,SMCs)的来源。然而,FISH 技术要以已知的核型结果为基础。如今,绝大多数的产前诊断实验室都选择荧光定量聚合酶链反应(quantitative fluorescent-polymerase chain reaction,QF-PCR)或者多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术快速检测常见的染色体三倍体,因为这些技术不需要经过细胞培养[5],成本较低。但是,QF-PCR 或者MLPA 技术不能检测染色体结构异常。

在临床实践中,有相当大一部分超声提示结构异常的胎儿不能得到明确的产前诊断,这是因为传统的染色体分析方法无法识别这些异常,而认为这些异常胎儿的核型是"正常"。事实上,这些异常胎儿中很大一部分的基因组发生了细微的不平衡畸变,其中细小的缺失和重复是最常见的类型。微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization,array-CGH)技术的发展和应用在很大程度上使上述问题得到解决。

一、array-CGH 技术的发展

array-CGH 技术是在其前身——比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)技术的基础上发展延伸而来。Wessendorf等[6]在2002年将CGH 技术与芯片技术相结合,形成了真正的array-CGH 技术。array-CGH 技术克服了传统的染色体核型分析技术的局限性,具有高通量、高分辨率、快速的优点,一次实验即可检测待测样本整个基因组拷贝数的变化。其基本原理是将等量的经过不同荧光标记(或生物素标记)的待测DNA 和标准参照DNA 同时杂交到分布有标准人类全基因组寡核苷酸探针的微阵列上,经配套扫描仪扫描,计算机软件分析,将待测DNA 和对照DNA 信号强度进行计算机换算处理,以研究待测样本基因组拷贝数的变化。该技术不仅分辨率高(可精确到50 bp),而且不需要制备中期染色体,只需要少量DNA,耗时仅72 h。array-CGH 技术能够可靠地检测出所有由染色体微缺失或微重复引起的基因组不平衡改变,并且可精确定位,清楚显示异常片段内的基因含量,因此能够快速发现、鉴定疾病相关基因。

array-CGH 技术自从出现以来,主要被用于肿瘤的全染色体组分析,在其他遗传病方面的研究鲜有报道,2007年几位研究者应用array-CGH 技术对不明原因智力低下和先天性异常患者进行诊断之后[7-9],人们开始真正讨论array-CGH 技术是否也可以用于检测从羊水或者绒毛中提取的DNA[10-11]。到目前为止,应用array-CGH 技术对出生缺陷患者进行检测能够检出的已知微缺失/微重复综合征已经超过400种,新的综合征还在不断地被发现。

二、array-CGH 技术在产前诊断中的应用

1.回顾性研究:在产前诊断方面,最开始的报道是应用array-CGH 技术对显微镜下看到的不平衡染色体异常进行验证分析。2006年,Rickman等[12]首次成功应用2种以细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes,BAC)为探针的芯片技术,对30例已知不平衡染色体异常、未经培养的羊水细胞进行分析,这2种芯片的分辨率都为1Mb,结果检出29例不平衡染色体异位,另外1例不能检出的核型是三倍体。该研究认为,array-CGH 是一种快速并且较低劳动密集型的技术,由于具有高分辨率、高通量并且易于自动化操作的特点,在检测非整倍体方面可以替代传统染色体核型分析[13]。Bi等[14]应用寡核苷酸探针的芯片对从新鲜羊水中提取的15例DNA 样本进行分析,其中2例样本的DNA 量极少,研究结果证明了寡核苷酸芯片的临床实用性。由于array-CGH 技术可能会检出不明临床意义的拷贝数变异(copynumber variations,CNVs),因此array-CGH 技术最初只是被应用于产前诊断中的回顾性研究,即在超声提示结构异常的胎儿引产之后再进行分析,以验证超声检查的结果[15]。

为了分析array-CGH 技术的检测效率,LeCaignec等[16]应用商业化的BAC、P1衍生人工染色体(P1-derivedartificialchromsomes,PAC)探针芯片对石蜡包埋的胎儿组织进行分析,这些胎儿都是发生3处或以上多发畸形,且常规核型分析结果正常。array-CGH 结果在排除遗传自亲代的不平衡异常和多态性改变后,发现致病性不平衡改变占8%(4/49)。Tyreman 等[17] 应用单核苷酸多态性(sing le nucleotide polymorphism,SNP)芯片对106例随机挑选的超声结构异常但染色体核型正常的样本进行研究,结果识别35例CNVs,其中9%的CNVs是致病性的。同时,该研究中有1例三倍体的样本同样能够被SNP芯片检测出来。另外一项回顾性研究应用寡核苷酸芯片对50例多发畸形但常规核型分析结果正常的胎儿进行研究,结果发现致病性CNVs占10%[18]。array-CGH 技术的检出率在指征不同的样本和不同人群中具有明显的不同。Faas等[19]应用250kSNP芯片对32例超声提示多发畸形但常规核型分析结果正常的产前诊断病例进行分析,致病性CNVs检出率为16%。在所报道的回顾性研究中,应用SNP 芯片能够检测出单亲二倍体(uniparental disomy,UPD),即分别为父源性UPD4 和母源性UPD16。这些结果说明SNP芯片具有能够检测UPD的优势。

2.前瞻性研究:在产前诊断前瞻性研究方面,最早报道的是Sahoo等[20]的研究。该研究在胎儿具有染色体异常高风险的98例孕妇中,同时采用全基因组array-CGH 技术和传统核型分析技术进行分析,其中74% 的夫妇愿意接受array-CGH 技术检测。应用全基因组array-CGH 技术分析的产前诊断样本,从新鲜羊水中提取的DNA 都经过基因组的扩增,从绒毛中提取的DNA 视质量情况根据需要进行基因组扩增,从培养的羊水中提取的DNA 不用进行基因组扩增。研究结果提示,array-CGH 技术检出的结果与常规核型分析结果完全吻合,但array-CGH 技术不能识别其中1例罗伯逊平衡易位[20]。在另外一项前瞻性研究中,Shaffer等[21]应用靶向芯片对151例产前诊断样本进行分析,这些靶向探针仅覆盖重大的染色体异常区域,重大遗传病的检出率为1.3%。在该研究中,最常见的产前诊断指征是胎儿超声结构异常(73%),其他的指征主要是夫妇焦虑(13.2%)和家族史(12.6%)。在应用array-CGH 技术检出的结果中,有0.6% 的病例检出不明临床意义的CNVs。在另外一项前瞻性研究中,VandenVeyver等[22]同样应用靶向芯片对300例产前诊断样本进行分析,研究结果表明重大遗传病的检出率为1.4%,不明临床意义的CNVs 检出率为1%。然而,Coppinger等[23]在另外一项研究中,应用全基因组芯片对182例产前诊断样本进行分析,致病性CNVs的检出率提高到2.7%,而不明临床意义的CNVs的检出率与靶向芯片水平一样,并未增加。由此可见,不明临床意义的CNVs的检出与芯片探针的覆盖范围没有密切关系。

2009年11月,美国遗传学协会(American Committeeon Genetics)发布了关于array-CGH 技术在产前诊断中应用的公告[24],推荐传统的染色体核型分析技术仍然是产前诊断的主要方法,提倡使用靶向芯片进行检测,强调在应用array-CGH 技术检测之后要特别注意产前和产后的遗传咨询。在考虑把array-CGH 技术作为常规的产前诊断方法之前,首先进行大规模的人群筛查研究是很必要的。

最能够体现array-CGH 技术在产前诊断中的应用价值的是应用array-CGH 技术对超声发现结构异常但常规核型分析结果正常的产前诊断样本进行分析。因为在现有的研究报道中,这部分研究对象虽然数量比较少,入选的指征标准也不同,但array-CGH 技术检出的重大致病性结果都很明显。无论产前诊断指征是什么,在常规核型分析结果提示正常的样本中,array-CGH 技术能够额外检出3.6%的遗传病,如果产前诊断指征是胎儿超声结构异常,那么检出率将提高到5.2%[25]。一个加拿大的研究团队报道,应用全基因组芯片

对48例多发畸形但染色体核型分析结果正常的胎儿进行研究,重大遗传病的检出率是8.2%[26],而不明临床意义的CNVs的检出率同样高达12.2%,原因是未对父母样本进行分析。

最近有研究应用44k的寡核苷酸芯片,探针主要覆盖已知的微缺失综合征位点、端粒区以及围着丝粒区的位点,在48 例颈项透明层(nuchal translucency,NT)增厚(>3.5 mm)的胎儿样本中检出的致病性CNVs占8.3%,其中2例胎儿合并超声扫描无法识别的结构异常[27]。另外一种能够显示array-CGH 技术巨大价值的产前诊断指征是胎死宫内。因为在这些样本中,胎儿细胞培养的失败率高达30%,而array-CGH 技术检测的成功率是98%,重大遗传病检出率是9.8%[28-29]。

2010年,由国际标准细胞遗传学联盟发起的针对全球所有应用array-CGH 技术对临床遗传病患者研究的文献报道进行的综述得出结论:在原发性智力低下和先天性异常患者中,array-CGH 技术的检出率为15%~20%,而标准的染色体核型分析技术检出率只有3%。因此,强烈推荐把array-CGH 技术作为原发性智力低下、先天性发育异常以及孤独症患者的临床一线诊断方法[30]。基于此,2010年加拿大遗传协会(CanadianCollegeofMedicalGeneticists)发布了相关指南,规定array-CGH 技术可以作为对上述临床指征患者的临床一线诊断方法,对超声发现的胎儿结构异常、常规方法发现的新发平衡易位以及具有高危家族史的产前诊断样本进行产前诊断[31]。虽然如此,array-CGH 技术是否能取代传统的核型分析方法应用于产前诊断一直存在争议[32]。

三、array-CGH 技术与传统核型分析方法比较

1.array-CGH 与标准染色体核型分析技术比较:与传统G显带染色体核型分析相比,array-CGH 技术属于低劳动密集型技术,无需经过细胞培养制备中期染色体,并且所需样本量极少。另外,array-CGH 技术的显著优势是能够检测显微镜下无法识别的细小缺失和重复,检出率的高低与芯片上探针的覆盖密度密切相关。绝大多数的研究报道均主要强调全基因组array-CGH 技术对微缺失和重复有较高的检出率,但关于array-CGH 技术在产前诊断应用过程对染色体平衡易位、多倍体、嵌合体、UPD 以及SMCs等的检测情况较少提

及。具体见表1(略)。

2.array-CGH 技术与标准染色体核型分析方法的遗传咨询比较:对于临床遗传咨询来说,遗传咨询师对array-CGH 技术产前诊断结果的解释经验远远落后于对传统核型分析结果的解释经验。在临床实践中,超声提示结构异常的胎儿,可能患有某种已知的染色体病,临床医生对于此方面的遗传咨询已经积累了丰富的经验[50]。然而,对于array-CGH 技术可能检测出来的某种异常或者是复杂染色体异常,其临床意义却是不能预知的[51]。这种未知的情况使得在遗传咨询中无法准确进行侵入性操作手术的风险-利益评估。另外,几乎所有由传统核型分析方法检测得到的染色体结果其临床意义都是已知的,然而随着芯片分辨率的不断提高,array-CGH 技术所产生的不明临床意义CNVs结果也在增加,从而增加了患者的焦虑,甚至有可能基于不确定性结果而终止妊娠。为了能够准确判断和解释array-CGH 技术的结果,在产前诊断中必须同时对胎儿的生物学父母样本进行分析,如果未能对父母之一进行分析,则不确定性结果的检出风险将会增加,但对胎儿及其父母进行array-CGH 技术的检测并不能检出单基因遗传病。所以,对于从事遗传咨询工作的人员来说,熟悉每项技术本身的局限性及其伴随的风险必不可少。

四、array-CGH 技术在未来产前诊断中的应用展望

近年的研究表明,通过对孕妇血浆中游离胎儿DNA 进行分析,能够可靠地对21、13、18-三体进行诊断[52]。在过去,人们也曾经努力尝试分离孕妇外周血中的胎儿细胞[53-55],然而成功的并不多。虽然这些胎儿细胞确实是获取胎儿遗传物质的一个纯正来源,得到这些细胞之后只需要应用最简单的技术方法,例如FISH 就能快速做出诊断,但是分离胎儿细胞的过程被证明是有问题的,且耗时费力[56]。因此,目前的研究都聚焦在胎儿游离DNA 或者RNA。Lo等[57]首次报道孕妇血浆中存在胎儿游离DNA。当无创性产前诊断技术发展成熟时,相信会有更多的孕妇选择接受产前诊断,尤其是唐氏综合征高危人群将显著受益于无创性产前诊断的发展。另外一个能够得到飞速发展的是妊娠早期唐氏综合征胎儿的筛查,目前的筛查方案假阳性率仍然较高,未来将直接进行诊断,而不是筛查。应用潜在的生物标记,例如胎盘来源的多肽,将可以进行妊娠中期的无创性产前诊断。经过这序贯检测之后,只有极少数的唐氏综合征高危孕妇需要接受侵入性的产前诊断[56]。未来可能的产前诊断操作流程总结如图1。