孕蜕膜组织淋巴细胞在妊娠中的作用

【摘要】 目的 探讨子宫内膜局部免疫细胞在妊娠中的作用。方法 采用免疫组化
技术和原位杂交技术，研究20例正常孕妇的早孕蜕膜组织内淋巴细胞的分布、表型特
征及穿孔素蛋白和mRNA的表达。结果 早孕蜕膜组织内T总淋巴细胞(CD₃⁺淋巴细胞)、
抑制或杀伤T淋巴细胞(CD₈⁺淋巴细胞)较少，约占3%；辅助T淋巴细胞(CD₄⁺淋巴细胞)
极少，甚至看不到。早孕蜕膜组织内大部分淋巴细胞为表达穿孔素的自然杀伤样细胞
(CD₅₆⁺非典型淋巴细胞)，约占70%。结论 早孕蜕膜组织中淋巴细胞分布以CD₅₆⁺非典
型淋巴细胞为主是其特点，其淋巴细胞的分布有利于胚胎着床、发育及维持正常妊娠。

【关键词】 蜕膜 淋巴细胞 膜糖蛋白类 妊娠初期


The Role of Decidua Tissue Lymphocytes in Early Pregnancy Tian Xiuzhu^*,
Zhang Lizhu, Wu Yan, et al. ^*The First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001

【Abstract】 Objective To investigate the role of lymphocytes in early pregnancy
decidua tissue. Methods Immunohistochemical and in situ hybridization techniques were
employed to demonstrate the population, phenotype and mediator of lymphocytes in
early pregnancy decidua. Results In early pregnancy decidua, CD₃⁺ T lymphocytes and
CD₈⁺ suppressor/cytotoxic T lymphocytes were very few. CD₄⁺ helper lymphocytes
were few and CD₅₆⁺ lymphocytes (also named NK-like cell) were abundant. CD₅₆⁺ l
ymphocytes containing perforin protein and expressing perforin mRNA were observed.
Conclusions The lymphocytes in early pregnancy decidua are specific and may play an
important role in early pregnancy. They probably exert some positive influence on
embryo implantation and placental development, and maintain the balance between
trophoblastic cells and decidua tissue.

【Key words】 Decidua Lymphocytes Membrane glyco
proteins Pregnancy trimester, first


母体免疫系统不排斥做为半同种移植物的胎儿，是一非常复杂的过程。此种免疫调
节作用不仅发生于母体全身免疫系统，而且也发生在妊娠子宫局部，这种局部免疫
因素的调节更直接地影响着胚胎的着床、发育，在保护胎儿存活中起着关键作用。
近年来，人们对早孕蜕膜组织淋巴细胞进行了研究，并发现了其规律^［1］。但对其
效应产物穿孔素的研究报道较少。本研究采用免疫组化技术与原位杂交技术，观察
人早孕蜕膜组织中淋巴细胞及其效应产物穿孔素的表达，探讨其在妊娠中的作用。

资料与方法

一、研究对象

20份早孕蜕膜组织来自1995年5月在我院计划生育室行人工流产的20例正常孕妇
，年龄26～30岁，身体健康，妊娠周数6～8周。将蜕膜组织取出，去除表面血迹，液
氮内迅速冻存。

二、方法

1.蜕膜组织淋巴细胞的分离：采用机械分离法。将蜕膜组织漂洗、剪碎，53 μm
细胞筛过滤，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，漂洗后将此细胞放入RPMI 1640+10%
小牛血清培养液中，37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养过夜，回收悬浮的淋巴细胞，固
定后备存。

2.早孕蜕膜组织淋巴细胞分布测定：对蜕膜组织冰冻切片及分离的淋巴细胞进行
免疫组化ABC法检测。Ⅰ抗为鼠抗人CD₃、CD₄、CD₈、CD₅₆抗体(丹麦Dako公司生产)，
鼠抗人穿孔素抗体由美国迈阿密大学提供；Ⅱ抗为生物化羊抗鼠IgG；Ⅲ抗为辣根酶
标记的链霉卵白素(购自中山生物技术有限公司)。主要步骤均按ABC免疫组化试剂盒
内说明进行。双重免疫组化法选用双ABC法，中间洗脱过程选用甘氨酸-盐酸洗脱液，
0.5%焦亚硫酸还原。结果判定：光镜下观察细胞阳性信号分别为红色、棕黄色、蓝色，
分别在蜕膜间质细胞膜表面和细胞浆内表达。各类阳性淋巴细胞和穿孔素阳性淋巴细
胞半定量测定：每张切片随机选取5个高倍视野，计算阳性细胞占全部间质细胞的百分
比。并设以磷酸缓冲液代替Ⅰ抗、Ⅱ抗、Ⅲ抗的阴性对照，阳性对照选自外周血淋巴
细胞。

3.早孕蜕膜组织穿孔素mRNA表达的测定：(1)穿孔素探针制备：人穿孔素质粒
PTZ19u由美国迈阿密大学提供；人穿孔素质粒DNA转化、提取、鉴定、回收，采用碱裂
解法与低溶点琼脂糖凝胶DNA片段回收技术。(2)早孕蜕膜组织穿孔素mRNA表达的测定：
采用原位杂交法，穿孔素cDNA探针标记采用非同位素地高辛检测试剂盒，冰冻切片8
μm。①杂交前处理与预杂交：切片经4%多聚甲醛固定，0.2 当量盐酸与蛋白酶K消化，
0.1 mol三乙醇胺乙酰化，加入预杂交液，42℃反应4小时；②杂交：将含有1 μg/ml
探针的杂交液95℃变性、冰内骤冷后，加入组织上，42℃杂交16～17小时。③杂交后
处理与杂交信号的检测：切片均用缓冲盐液漂洗，加入1∶500地高辛抗体4℃过夜，次
日加入底物5-溴-4-氯-3吲哚磷酸(BCIP)与显色原硝基四氮唑蓝(NBT)显色液，镜下观
察，阳性结果为细胞浆内可见紫蓝色mRNA颗粒，并设阴性对照，拍摄照片。

结果

一、早孕蜕膜组织淋巴细胞的分布

早孕蜕膜组织中典型的T总淋巴细胞(CD₃⁺淋巴细胞)、抑制或杀伤T淋巴细胞(C
D₈⁺淋巴细胞)数量较少，约占蜕膜间质细胞的3%，辅助T淋巴细胞(CD₄⁺淋巴细胞)在
早孕蜕膜组织中极少，甚至看不到。早孕蜕膜组织淋巴细胞中以自然杀伤样细胞(C
D₅₆⁺非典型淋巴细胞)为主，约占间质细胞的70%。见图1～5。

二、早孕蜕膜组织穿孔素蛋白的表达

早孕蜕膜组织与从蜕膜组织分离的淋巴细胞中可见穿孔素蛋白颗粒(图6)。用
双重免疫组化技术发现，无论早孕蜕膜组织或是分离出的淋巴细胞中，均可见细
胞膜着色为红色的CD₅₆⁺淋巴细胞，此阳性细胞内含有蓝色的穿孔素蛋白颗粒(图7)。

三、早孕蜕膜组织穿孔素mRNA的表达

1.人穿孔素cDNA片段的制备：如图8所示。

 A：DNA Marker

    B：人穿孔素质粒PTZ19u，片段长度3 420 bp

    C：EcoRI酶切后的PTZ19u

    D：纯化的穿孔素cDNA探针长度560 bp