内皮型一氧化氮合成酶基因在重度妊高征胎盘绒毛组织的表达

佟秀琴　李诗兰　赵扬玉　张小为　王蔼明

　　【摘要】　目的　探讨重度妊高征患者胎盘绒毛组织内皮型一氧化氮合成酶mRNA的表达。了解其与妊高征的关系。方法　用地高辛标记的内皮型一氧化氮合成酶探针，对9例正常孕妇(正常对照组)及9例重度妊高征孕妇(妊高征组)的胎盘绒毛组织总RNA进行点印迹杂交。利用Leica QWIN图像处理及分析系统测量每个杂交点的平均光密度值。结果　妊高征组胎盘绒毛组织内皮型一氧化氮合成酶mRNA的表达明显低于正常对照组，两组间差异有极显著性(P<0.001)。结论　重度妊高征组胎盘绒毛组织内皮型一氧化氮合成酶的减少，可能是导致胎盘功能不良和胎儿-胎盘循环血流阻力增加的原因之一，并在妊高征的发病中起重要作用。
　　【关键词】　妊娠并发症，心血管　　高血压　　胎盘　　氨基酸氧化还原酶类

　　妊高征确切病因至今仍不清楚，但在妊娠终止胎盘娩出后病情可迅速缓解，这说明胎盘在妊高征的发病中起重要作用。妊高征患者全身小动脉痉挛，包括胎儿-胎盘单位在内的重要器官血供不良与血管内皮损伤或功能障碍有关^［1］。我们选择正常妊娠及重度妊高征胎盘绒毛组织，提取总RNA，进行点印迹杂交，旨在了解妊高征胎盘绒毛组织内皮型一氧化氮合成酶mRNA的表达量与正常妊娠的区别，以寻找妊高征的病因。

资料与方法

　　一、对象
　　1996年8月至1997年4月，选择在我院产科住院患者 18例，其中正常妊娠9例(正常妊娠组)，年龄24～35岁，孕38～41周，无任何合并症及并发症，另9例为重度妊高征(妊高征组)，按文献［2］标准 行妊高征诊断，年龄22～34岁，无其它合并症，均为单胎初产妇，行选择性剖宫产者。
　　二、方法
　　1.标本采集：胎盘取出即刻，在胎盘中央取绒毛膜板下胎盘绒毛组织块1 cm×1 cm×1 cm，经磷酸缓冲液彻底清洗后液氮冻存。
　　2. RNA的提取：在无RNA酶的环境下用异硫氰酸胍一步法，提取组织总RNA。
　　3.点印迹杂交：取每一患者的RNA 5 μg，用抽滤加样器转至尼龙膜上，每一患者的RNA点1个孔(妊高征与正常妊娠交替点样)，80℃真空考膜2小时，用地高辛标记的内皮型一氧化氮合成酶cDNA探针行膜上杂交。
　　4.图像分析及统计学处理：利用Leica QWIN图像处理及分析系统测量每个点的平均吸光度(A)值。各组数值用(±s)表示，组间用t检验。

结果

　　一、点印迹杂交结果
　　我们用地高辛标记的内皮型一氧化氮合成酶cDNA 探针，对9例重度妊高征及9例正常妊娠妇女胎盘绒毛组织RNA在尼龙膜上进行点印迹杂交，以硝基氮蓝四唑避光显色，发现正常妊娠组妇女杂交点加入显色剂 后，15分钟左右开始显色；而妊高征组加入显色剂后，30分钟左右开始显色，显色1小时同时终止反应。妊高征组每一杂交点着色较正常妊娠组浅且略小，各组 不同孕龄样本间无明显差别。
　　二、图像处理结果
　　用Leica QWIN图像处理及分析系统测量每个杂交点的平均A值。妊高征组的平均A值为0.12±0.01 (±s，下同)，正常妊娠组为0.24±0.01。妊高征组胎盘绒毛组织内皮型一氧化氮合成酶mRNA的表达，明显低于正常妊娠组，两组间差异有极显著性(P<0.01)。

讨论

　　一、一氧化氮及其功能
　　1980年Furochgott等^［3］首次报道血管内皮细胞分泌一种物质能引起血管舒张，并将其称为内皮衍生松弛因子(EDRF)。1987年Plamer等^［4］研究证实，EDRF的本质是一氧化氮，体内产生一氧化氮的底物是L-精氨酸，一氧化氮可能先与一种含巯基的载体分子或组织纤溶酶原激活物结合，到达靶细胞后，一氧化氮从载体释放并透过靶细胞膜，进入靶细胞，当一氧化氮与鸟苷酸环化酶的Fe²⁺结合后，鸟苷酸环化酶被激活，酶的活性增加50～200倍，从而增加三磷酸鸟苷的转化速度，环-磷酸鸟苷水平的增加，加速细胞内自由钙的结合，引起血管平滑肌舒张。环-磷酸鸟苷也阻止血小板在血管内皮的粘附和聚集^［5］。一氧化氮还具有神经递质、DNA合成阻断剂、细胞毒素及抑制细胞生长因子的功能。
　　二、一氧化氮与妊高征胎盘绒毛组织间隙血栓形成的关系
　 　本研究中，我们用点印迹杂交的方法，证明妊高征胎盘绒毛组织内皮型一氧化氮合成酶mRNA的表达较正常对照组明显减少。我们已用一氧化氮合成酶多克隆抗 体的免疫组化及还原型辅酶Ⅱ黄递酶组化染色法，证明胎盘绒毛组织只有一氧化氮合成酶的表达，且分布在合体滋养细胞及除终末绒毛毛细血管外的胎儿血管内皮细 胞。此结果与Myatt的报道结果一致^［6］。合体滋养细胞因其直接与母血接触，其位置相当于血管内皮，它产生的一氧化氮可阻止血 小板的粘附和聚集，防止绒毛间隙血栓形成，重度妊高征时一氧化氮合成酶减少，导致滋养细胞表面血小板及白细胞粘附和聚集增加，这可能就是妊高征时绒毛间隙 血栓形成较正常妊娠增加1倍的主要原因^［7］。
　　三、一氧化氮与妊高征胎儿-胎盘循环阻力增加的关系
　　胎盘组织缺乏自主神经调节，因而胎儿-胎盘血流的调节主要靠局部产生的血管活性因子。一氧化氮在胎儿-胎盘血液动力学的调节方面起重要作用，有些学者的研究认为，一氧化氮在胎儿-胎盘循环中维持低循环阻力，降低该循环对血管收缩因子如内皮素-1、血栓素A₂的敏感性^［8］，已有报道，妊高征时胎儿-胎盘血流阻力增加^［9，10］，考虑与妊高征时胎盘组织一氧化氮的减少及对血管收缩因子的敏感性增高有关。因此，我们推测，一氧化氮减少可能是妊高征易并发胎儿宫内发育迟缓的原因之一。

参考文献

　1　Rober JM, Taylor RN, Goldfien A. Clinical and biochemical evidence of endothelial cell dysfunction in pregnancy syndrome pre-eclampsia. Am J Hyperten, 1991, 4:700-708.
　2　郑怀美主编.妇产科学.北京：人民卫生出版社.第3版.1991.110-120.
　3　Furochgott RF, Zawadski JV. The obligatory role of endothelial cell in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholin. Nature, 1980, 288:373-376.
　4　Plamer RMJ, Ferrige AG, Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature, 1987, 327:524-526.
　5　Susan P, Seligman MD. The role of nitric oxide in the pathogenesis of preeclapsia. Am J Obstet Gynecol, 1994, 171:944-948.
　6　Myatt L, Brockman D, Pqllok J, et al. Immunohistochemical localization of nitric oxide synthase in the human placenta. Placenta, 1992, 14:487-495.
　7　Perry KJ, Martin JN. Abnormal hemostasis and coagulopathy in preeclampsia and eclampsia. Clin Obstet Gynecol, 1992, 5:338-350.
　8　Mgatt L. Current topic: control of vascular resistance in human placenta. Placenta, 1992, 13:329-334.
　9　Trudinger BJ, Giles WD, Cook CM, et al. Fetal umbilical artery flow velocity wave forms and placent risistance: clinical significance. Br J Obstet Gynecol, 1985, 92:23-30.
10　李诗兰，谢道银，王泽密，等.肾小动脉和脐动脉血流变化与妊高征结局.中国超声医学杂志，1996，12：53-56.

(收稿：1997-10-07　　修回：1998-03-05)